تحليل البي سي آر–PCR

20٬891

– التحليل: تحليل البي سي آر– تحليل تفاعل البوليمراز المتسلسل – تحليل تفاعل البلمرة التسلسلي – PCR – Polymerase chain reaction

– المقصود بتحليل البي سي آر (PCR):

تقنية تستخدم لتضخيم كميات ضئيلة من الحمض النووي – DNA (وفي بعض الحالات، الحمض النووي الريبوزومي -RNA) الموجود في أو على أي سائل أو سطح تقريبا حيث توجد خيوط الحمض النووي.
ويكمن مفتاح فهم تقنية البي سي آر في معرفة أن كلا من الإنسان أو الحيوان أو النبات أو الطفيلي أو البكتيريا أو الفيروس يحتوي على مواد وراثية مثل الحمض النووي (أو الحمض النووي الريبوزومي) (والذي يتكون من سلسلة من النيوكليوتيدات أو قطع من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبوزومي) والتي تعتبر مميزة لكل نوع من الأنواع وأيضا مميزة لكل فرد من هذا النوع.
وبالتالي، إذا كانت العينة تحتوي على أجزاء من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبوزومي للفرد، وعن طريق استخدام تقنية البي سي آر لتضخيم (صناعة العديد من النسخ المتطابقة) من هذه التسلسلات الفريدة من نوعها بحيث يمكن استخدامها بعد ذلك لتحديد هوية المصدر (سواء أكان شخص معين، أو حيوان، أو أي من الكائنات المسببة للأمراض) من خلال تتبع الحمض النووي أو الحمض النووي الريبوزومي في أي عينة من المواد.
وتعتبر عملية التضخيم في تحليل البي سي آر هي جزء فقط من اختبار تحديد الهوية، حيث أنه وبمجرد الانتهاء من التضخيم، تحتاج إلى مقارنة نتائج التضخيم مع تسلسلات أخرى من النوكليوتيدات من مصدر معروف (على سبيل المثال، شخص معين، أو حيوان، أو كائنات مسببة للأمراض). وغالبا ما تتم هذه المقارنة من خلال وضع تسلسلات النيوكليوتيدات المتولدة عن تفاعل البوليميراز المتسلسل بجوار تسلسل النوكليوتيدات المعروف من البشر أو مسببات الأمراض أو من مصادر أخرى مع وجود مادة هلامية فاصلة. ويتم تمرير التيار الكهربائي من خلال المادة الهلامية، وتتشكل تسلسلات النيوكليوتيدات المختلفة فيما يشبه “السلم” وفقا للشحنة الكهربائية والحجم الجزيئي لكل نيوكليوتيدة، وهذا ما يسمى بالفصل الكهربائي الهلامي.

– كيف تم اكتشاف تقنية البي سي آر (PCR):

تم اختراع تقنية البي سي آر من قبل كاري موليس- Kary Mullis في عام 1983، بينما كان يعمل في امريفيل، كاليفورنيا لصالح شركة سيتوس، واحدة من أوائل شركات التكنولوجيا الحيوية. وهناك، تم تكليفه بصنع سلاسل قصيرة من الحمض النووي لعلماء آخرين.
وقد حصل موليس على جائزة نوبل في الكيمياء مشاركة مع مايكل سميث في عام 1993.

وكما كتب موليس في مجلة سسينتيفيك أمريكان: “بداية من جزيء واحد من الحمض النووي، يمكن لتفاعل البوليميراز المتسلسل أن ينتج 100 مليار جزيء مماثل في فترة ما بعد الظهر، وذلك عن طريق تفاعل سهل التنفيذ، ولا يتطلب أكثر من أنبوب اختبار، وعدد قليل من الكواشف البسيطة، ومصدر للحرارة. ”

– متطلبات تقنية البي سي آر:

العينة التي تحتوي على الحامض النووي المزدوج (Double stranded DNA) والذي يحتوي على الجزئ المراد نسخه، وقد تكون هذه العينة (من الدم، الشعر، القيح، أو جزء من الجلد، أو غير ذلك).
بادئ محضر صناعيا معروف تسلسل نيوكليوتيداته (Oliganucleotid Primer) ويتكون من 20 نيوكليوتيدة.
إنزيم بلمرة خاص مقاوم للحرارة (Polymerase) ويتم الحصول عليه من البكتريا المحبة للحرارة العالية المعروفة باسم (Thermus Aquatic).

– خطوات تقنية البي سي آر (PCR):

تحتوي العينة على عدد من نيوكليوتيدات الحمض النووي والتي تسمى (أدينين – Adenine، ثيميدين- Thymidine، سايتوسين – Cytosine و جوانين – Guanine. وعندما ترتبط هذه النيوكليوتيدات معا، فإنها تشكل تسلسل النيوكليوتيدات أو سلسلة واحدة من الحمض النووي. ويرتبط هذا التسلسل من النيوكليوتيدات مع تسلسل آخر مكمل من النيوكليوتيدات(على سبيل المثال، سوف يربط الأدينين فقط مع الثيميدين و الجوانين فقط مع السايتوسين). وبالتالي يتم تشكيل تسلسل نوكليوتيدات من الحمض النووي التكميلي وربطه بالحمض النووي الأصلي. وعند اكتمال الربط، يتم تشكيل الحمض النووي المزدوج.

الدنترة (تمسخ الحمض النووي المزدوج – Denaturation): تبدأ تقنية البي سي آر (PCR) مع شريحة من الحمض النووي من العينة التي يتم وضعها في أنبوب مع الكواشف المذكورة أعلاه. ويتم تسخين المحلول إلى 94 درجة مئوية على الأقل (201.2 فيهرنهايت)؛ وتعمل هذه الحرارة على تكسير الروابط الهيدروجينية التي تسمح بتشكيل الحمض النووي التكميلي، ليتحول الحمض النووي المزدوج (Double stranded) إلى خيط مفرد (Single stranded).
الالتحام (Annealing of the DNA): يسمح للخليط أن يبرد إلى حوالي 54 درجة مئوية (129.2 فيهرنهايت). في هذه الحرارة، يرتبط الإنزيم البادئ – Primer مع جزئ الحمض النووي المنفرد.
الاستطالة (Extension of the DNA): ثم بعد ذلك في درجة حرارة 72 مئوية C (161.6 فهرنهايت) يبدأ إنزيم البلمرة المقاومة للحرارة في إنتاج وحدات متكررة من الجزيء الأصلي Unit Length Double stranded DNA.

وتكرر هذه الدورة حوالي 40 مرة في جهاز ذاتي العمل يطلق عليه جهاز التكرار الذاتي الحراري (Automated Thermal Cycler) والذي يكرر تلقائيا دورات التبريد والتسخين مع إنتاج كمية مضاعفة من تسلسل الحمض النووي في كل مرة يتم الانتهاء من دورة الحرارة. ويمكن تضخيم شريحة قصيرة واحدة من الحمض النووي إلى حوالي 100 مليار نسخة بعد 40 دورة من العمل.

– أنواع خاصة من تقنية البي سي آر (PCR):

هناك ما لا يقل عن 25 نوع من الأنواع الفرعية لتقنية البي سي آر (PCR) والتي تعتمد جميعها على نفس التقنية الأساسية مع اختلافات بسيطة.

1. تفاعل البي سي آر باستخدام إنزيم النسخ العكسي (RT-PCR- Reverse transcriptase-polymerase chain reaction):

هو اختبار خاص من تفاعل البوليمراز المتسلسل والذي تم تصميمه للكشف عن الحمض النووي الريبوزومي (RNA) وقياسه.
فعلى الرغم من أن اختبارات البي سي آر القياسية تعمل على تضخيم الحمض النووي DNA ، فإن العديد من الفيروسات والمكونات البيولوجية الأخرى (على سبيل المثال، الميتوكوندريا) تستخدام الحمض النووي الريبوزومي كمادة وراثية.
ويختلف تفاعل البي سي آر باستخدام إنزيم النسخ العكسي عن البي سي آر التقليدي في أنه يتم أولا تحويل الحمض النووي الريبوزومي-RNA إلى الحمض النووي-DNA.
ويتم ذلك عن طريق نفس الأسلوب لتقنية البي سي آر المذكورة أعلاه باستثناء استخدام انزيم يسمى إنزيم النسخ العكسي (reverse transcriptase) بدلا من إنزيم بلمرة الحمض النووي (DNA polymerase)
ويعمل إنزيم النسخ العكسي على ترجمة نسخة الحبل النووي الريبوزومي (strand of RNA) إلى نسخة تكميلية من الحمض النووي (complementary strand of DNA). وبمجرد حدوث هذا التفاعل، يمكن استخدام تنقية البي سي آر الروتينية لتضخيم ومضاعفة الحمض النووي.

2. تفاعل البي سي آر في الوقت الحقيقي (Real-Time PCR):

هو نوع خاص من البي سي آر يسمح بتحليل عملية تضخيم الحمض النووي خلال الـ 40 دورة المعتادة. وعلى الرغم من أنه مماثل لتحليل البي سي آر التقليدي، إلا أنه في هذا النوع تستخدم أصباغ من الفلورسنت على فروع النوكليوتيدات الصغيرة. واعتمادا على الطريقة المستخدمة، يحدث ومضان عندما يتم تشكيل خيوط الحمض النووي وتضخيمه. وبالتالي يمكن قياس كمية الومضان في كل مرحلة من الدورات الأربعين.
ويسمح هذا للباحثين قياس منتجات محددة وكمياتها خلال دورات تضخيم الحمض النووي.

– لماذا يتم طلب تحليل البي سي آر:

1. الكشف عن وتحديد الكائنات المسببة للأمراض، وخاصة تلك التي يصعب زراعتها (على سبيل المثال، فيروس نقص المناعة البشرية-HIV والفيروسات الأخرى وبعض الفطريات)، كما يستخدم للكشف عن التهابات الكبد ومنها التهاب الكبد سي:

- الاختبار الكمي لفيروس سي (الحمل الفيروسي- HCV quantitative
  test): ويستخدم للكشف عن وجود الفيروس من عدمه.
- اختبار النمط الجيني الفيروسي (HCV viral genotyping): يستخدم
  لمعرفة أي نمط جيني للفيروس هو المسئول عن التهاب الكبد. وهناك ستة من الأنماط
  الجينية لفيروس الكبد سي.

2. المساعدة في تشخيص الأمراض الوراثية.

3. الكشف عن العلاقات البيولوجية مثل تحديد الآباء والأمهات عند الشك في نسب بعض الأطفال، وكذلك في حالات الاغتصاب.

4. تحديد ووصف الطفرات الوراثية في بعض أنواع السرطان.

5. تعين البصمات الوراثية.

6. العنصر الأهم في عملية التجميع الجيني (Recombinant DNA) للحمض النووي، وهي تقنية تقوم بتكثير ومضاعفة الجين المراد إدخاله على البلازميد أو الحمض النووي المضيف، وتستخدم هذه الطريقة في صناعة مصل التهاب الكبد بي (Hepatitis B vaccine).

7. الدراسات المرتبطة بمشروع الخارطة الجينية البشرية (Human Genome Project).

– المصادر: